CAR T 细胞疗法已经在血液系统恶性肿瘤中取得了巨大成功，但目前尚未在实体瘤中取得成果。主要由于血液瘤与实体肿瘤之间存在着明显的差异。例如，在实体肿瘤中存在较少的靶抗原。另外许多实体瘤是 “冷”肿瘤，免疫细胞对TME的浸润性很差。由于免疫抑制的TME，即使有大量免疫细胞浸润到肿瘤中，免疫细胞也不能很好的发挥作用。

与CAR T细胞相比，CAR NK细胞有几个优势，包括免疫细胞来源丰富，没有GvHD等优势。然而与CAR T细胞治疗相关的大多数障碍也适用于CAR NK细胞。由于CAR T和CAR NK细胞治疗的这些障碍，最近 CAR macrophages已成为一种替代疗法。虽然 CAR macrophages与CAR T细胞有许多共同的特征和障碍，如对特异性抗原的需求、抗原逃逸和下调以及全身性细胞因子毒性等。然而，与CAR T细胞相比，CAR macrophages在实体肿瘤治疗两个主要障碍上具有独特的优势：免疫细胞向TME的迁移和浸润，以及免疫抑制TME(表1)。本文就CAR macrophages的独特优势，CAR结构，以及近年来的进展做一个简要介绍。

表1. CAR T、NK和macrophages的比较

对于免疫细胞向TME的迁移和浸润，巨噬细胞在许多肿瘤中大量存在，而不像T细胞的低迁移和浸润。新鲜的冰冻肿瘤切片显示，在许多癌症类型中，巨噬细胞占肿瘤浸润性细胞的大部分，在黑色素瘤、肾细胞癌和结直肠癌中高达50%。巨噬细胞在TME的浸润得益于肿瘤部位许多细胞因子的分泌。低氧诱导肿瘤细胞和基质细胞产生的细胞因子，如CCL2、CXCL12、CSF1和VEGF可以募集巨噬细胞。一旦被招募到低氧的TME中，这些可溶性因子的受体被下调，从而将巨噬细胞锁定在TME中。此外，巨噬细胞可以直接感知低氧条件及其代谢产物，如低pH值，并迁移到TME。

TME的另一个主要障碍是免疫抑制微环境，这对T细胞来说是一个主要障碍，但对巨噬细胞来说不是那么重要。由于免疫抑制微环境，浸润到肿瘤部位的T细胞通常会出现衰竭表型，而且免疫检查点抑制剂经常无法逆转这种表型。巨噬细胞的情况可能并非如此。巨噬细胞大致分为两大类，经典激活的促炎M1巨噬细胞和交替激活的抗炎M2巨噬细胞。TAMs，特别是M2 TAMs，被广泛认为是TME的中枢免疫抑制细胞群之一。虽然M2巨噬细胞抑制了其他免疫细胞的功能，但它们自身仍具有吞噬能力。事实上，M2巨噬细胞的吞噬能力高于M1巨噬细胞。此外，巨噬细胞具有较高的表型可塑性，这使得它们能够对环境刺激做出反应并改变表型。

CAR macrophages中的CAR具有与CAR T细胞相同的结构，具有细胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内区(图1)。但它们在细胞内的信号域上有所不同。CAR macrophages可以直接使用包含 ITAM的CD3ζ结构域。在CAR T细胞中，当CAR参与时，ITAM被Src家族的激酶磷酸化，结合到激酶ZAP70中的串联SH2(tSH2)结构域，并激活CAR T细胞以发挥细胞杀伤作用。巨噬细胞不表达ZAP70，而表达另一种含有tSH2结构域的激酶Syk，可以与CD3ζ结合，并在巨噬细胞中传递吞噬信号。

图1. CAR macrophages的CAR结构

除了CD3ζ ITAM，其他含ITAM的胞内结构域，如Fc受体的γ亚单位(FcRγ)和Megf10也被使用，并能诱导与CD3ζ类似的吞噬作用。FcRγ转导巨噬细胞中抗体依赖的细胞吞噬作用的典型信号。Megf10在巨噬细胞吞噬凋亡细胞过程中起关键作用。

与第二代和第三代CAR T细胞类似，一个额外的信号域也可以增强吞噬功能，并在 CAR macrophages中观察到类似的发现。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路对巨噬细胞吞噬大颗粒很重要。研究发现CD19 PI3K-Recruiting结构域与CAR FCRγ的串联融合可使吞噬功能增加两倍。

到目前为止， CAR macrophages还处于起步阶段，基本上还都处于临床前阶段。只有一项使用自体 CAR macrophages靶向HER2过表达实体瘤的I期临床试验正在进行（表2)。

表2. CAR macrophages的临床前和临床研究

Morrissey等人系统的分析了CD19和CD22靶向的 CAR macrophages的胞内结构域。研究发现含有ITAM的 CD3ζ、FcRγ或Megf10任何一个胞内结构域的CAR macrophages，具有相似的吞噬效率，而含有Bail和MerTK胞内区的 CAR macrophages则不能与靶细胞结合。大多数 CAR macrophages只内化靶细胞的碎片，整个细胞被吞噬的情况很少见。含有FcRγ-PI3K募集结构域的CD47可增强巨噬细胞的吞噬功能，但孵育4~8h后，仍只有不到10%的巨噬细胞含有完整的靶细胞。

Klichinsky等人报道了基于CD3ζ的抗HER2 CAR macrophages的产生和特性。在该研究中，使用腺病毒载体可以将CAR高效地转染到巨噬细胞。腺病毒感染诱导 CAR macrophages 向M1分化，使TME向促炎表型倾斜。此外，腺病毒转导的 CAR macrophages作为专业的抗原提呈细胞，除了靶抗原外，还可以交叉递送肿瘤来源的抗原，以更有效地激活T细胞。体内实验证实了这些 CAR macrophages显著延长了携带肿瘤移植物的小鼠的存活时间，并减少了肺转移。

L. Zhang等人报道的一项研究，解决了使用诱导多能干细胞(iPSCs)来源的 CAR macrophages进行癌症免疫治疗效率低的问题。在本研究中，用编码重编程因子的非整合载体诱导iPSC克隆。然后将含有CD86和FcRγ胞内区的CAR基因导入iPSC诱导的巨噬细胞。这些iPSC衍生的表达CAR的巨噬细胞(CAR-iMACs)具有M2表型。然而，一旦与靶细胞相遇，这些CAR-iMACs就会吞噬靶癌细胞，并向促炎症的M1表型倾斜。体内研究表明，CAR-iMACs能够扩增、持续存在并发挥其抗肿瘤活性。

W. Zhang等人使用 CAR macrophages解决了由于细胞外基质(ECM)导致的免疫细胞对肿瘤浸润不足的问题。ECM为T细胞浸润到肿瘤部位并发挥其抗癌免疫作用创造了一个物理屏障。靶向癌症相关成纤维细胞或基质降解酶--肝素酶的CAR T细胞可以促进免疫细胞的浸润，增强抗肿瘤免疫。在W. Zhang使用的 CAR macrophages中，靶向HER2的单链抗体连接了铰链区、CD147跨膜区和胞内区，从而产生CAR-147 macrophages（图2）。CD147通过表达基质金属蛋白酶(MMPs)对ECM重塑起重要作用。由于CD147不传递吞噬信号， CAR macrophages与靶细胞的结合显著上调了某些MMPs的表达，但不影响巨噬功能。与体外实验结果一致，体内研究发现CAR-147巨噬细胞上调了某些MMPs的表达，显著降低了肿瘤中的胶原含量，增加了T细胞的浸润，并抑制了肿瘤的生长。

图2. CAR-147 macrophages的产生及作用机制示意图

Niu等人报道了一项利用 CAR macrophages靶向表达CCR7的免疫抑制细胞用于癌症免疫治疗的研究。该小组设计了表达CCR7天然配体CCL19作为胞外区的 CAR macrophages，以靶向表达CCR7的免疫抑制细胞。为了建立一个最佳的CAR结构域，使用并比较了下列胞内结构域：TLR2、TLR4、TLR6、MerTK或经典的CAR-T激活结构域4-1BB-CD3ζ。含MerTK的 CAR macrophages体外吞噬和杀伤活性最强。低剂量便能诱导T细胞进入肿瘤、增加促炎细胞因子的产生、抑制肿瘤生长和减少转移且毒性较小。

到目前为止，只有一项针对 CAR macrophages的I期临床试验(NCT04660929)。这项临床试验是基于Klichinsky等人开发的 CAR macrophages。本试验使用的是腺病毒载体Ad5f35改造的 CAR macrophages，并携带靶向HER2的单链抗体。腺病毒感染诱导巨噬细胞分化为促炎症的M1样表型。这项临床试验已于2021年2月开始。到目前为止还没有更多的结果报告，我们期待后续的临床进展。

CAR macrophages的研究仍处于初级阶段，目前只有一项临床试验启动，尚未有结果报告。因此，许多可能最多的限制尚未显现。目前正在已经进行大量的工作，以优化 CAR macrophages的结构、制造、储存、肿瘤浸润和在TME的细胞毒性。使用CAR macrophages的主要优点是它易于迁移和浸润到肿瘤中，而且促炎症的M1表型和抗炎的M2表型之间具有可塑性。总之，我们期待CAR macrophages的更多进展，也许它在解决CAR T和CAR NK治疗未被满足的临床需求方面是一个非常好的选择。

参考文献

1.CAR race to cancer immunotherapy: from CAR T, CAR NK to CAR macrophage therapy.

2.CAR-macrophage: A new immunotherapy candidate against solid tumors.

3.Chimeric antigen receptors that trigger phagocytosis.

4.Human chimeric antigen receptor macrophages for cancer immunotherapy.

5.Pluripotent stem cell derived CAR macrophage cells with antigen‑dependent anti‑cancer cell functions.